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时间：2016-07-22来源：飞测生物点击量：
摘要：对上海飞测生物科技有限公司研发生产的黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条在粮食谷物饲料中的检测性能进行了评估。该产品的最低检出限（LOD）为0.29μg/kg，最低定量限(LOQ)为0.91μg/kg，线性范围为1.00-50.00μg/kg，线性范围内的添加回收率为92.89%~121.07%，3次重复的变异系数在14.56%以内。与其他真菌毒素的交叉反应率均小于5%。该产品具有操作简便、灵敏准确、快速定量、重现性好等优点，适合用于对粮食谷物饲料中黄曲霉毒素B1的进行快速定量测定。
关键词：黄曲霉毒素B1检测试纸条；荧光定量免疫层析；黄曲霉毒素B1；粮食谷物饲料
黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1简写为AFB1）是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素），具有强致癌性以及剧毒性，是迄今发现的各种真菌毒素中最稳定的一种。从1993年开始黄曲霉毒素被认定为世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定的一类致癌物，是世界公认的三大强致癌物质之一，而黄曲霉毒素B1由于毒性最大，污染最重，是危害最大的一种黄曲霉毒素。
黄曲霉毒素B1污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油食品，且以南方高温、高湿地区受污染最为严重。目前，GB 2761-2011《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》中对粮食谷物及其制品中黄曲霉毒素B1的最高限量为20μg/kg。GB13078-2001《饲料卫生标准》中对不同种类的饲料中黄曲霉毒素B1的最高限量标准从10-50μg/kg。
目前，国标法测定黄曲霉毒素B1采用HPLC法，需要大型的仪器设备，价格昂贵，操作过程复杂、时间较长，且无法在现场和基础小型实验室使用。除此之外，也有采用黄曲霉毒素酶联免疫试剂盒或胶体金快速检测试纸条用于大量样品的筛查，操作简便，检测快速，成本也较低，但准确性和重复性较差，容易造成假阳性或者假阴性。因此，急需一种既简便快速，又能准确定量的检测方法，荧光定量免疫层析正好可以满足这种需求。本文通过对多种粮食谷物饲料样品的实测，验证了上海飞测生物开发的黄曲霉毒素B1荧光定量快速检测试纸条的技术性能。
1实验材料和方法
1.1试剂和材料
除注明外，均为分析纯，试验用水均为UP水。
黄曲霉毒素B1荧光荧光定量检测试纸条（由包被有荧光微球标记黄曲霉毒素B1抗体的乳胶垫、喷涂有黄曲霉毒素B1抗原的检测线和喷涂有羊抗鸡二抗的控制线的NC膜、样品垫及吸收垫组成）、样品提取液、样品稀释液、标准曲线ID卡及标准曲线条形码均由上海飞测生物科技有限公司提供。
黄曲霉毒素B1及其他真菌毒素的标准品：购自Sigma公司；
大米、玉米、小麦、面粉等样品从超市购得或从企业取样。
麸皮，小麦、面粉等饲料样品从饲料厂和企业取样。
1.2仪器与设备
FD-100型荧光免疫定量分析仪和FD-5000型试纸条恒温孵育器，上海飞测生物科技有限公司提供；低速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；漩涡振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；电子天平：Sartorius；
1.3试验方法
1.3.1样品的前处理
取具有代表性的待测样品500g，用小型粉碎机粉碎1min后过20目筛，收集过筛的细小样品。称取1.0±0.02g过筛的样品于10mL离心管中，加入5mL提取液，用漩涡混匀仪震荡5min(或者摇床振荡10min）后，4000RPM离心1min，取上清。
1.3.2检测过程
取50μL离心上清液加入500μL样品稀释液中，用漩涡混匀器混匀3-5s，然后取100μL加入到黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条的加样孔中，置于37℃恒温孵育器中温育10min后，将试纸条插入荧光免疫定量分析仪中读数，即为样品的实际检测浓度。当检测值大于50μg/kg时，可用提取液将离心上清液稀释5倍后再进行检测，所得读数值乘以对应的稀释倍数即为最终的检验结果。
2检测结果分析
2.1线性范围与检出限
在样品提取液中，分别添加1.00μg/kg、2.50μg/kg、5.00μg/kg、10.00μg/kg、25.00μg/kg、50.00μg/kg 的黄曲霉毒素B1标准品，用上海飞测生物黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条每个样品检测3次，以添加浓度为为纵坐标，以荧光定量检测试纸条的检测结果为横坐标，拟合曲线并计算线性相关系数，结果如下：
图1 黄曲霉毒素B1标准品添加与荧光定量试纸条检测值的线性关系
计算得出小麦的线性范围：1.00～50.00μg/kg（6点）， 回归方程: y = 1.042x + 0.540,相关系数R² = 0.998；（见图1）。
取10个无污染（阴性）小麦样品、10个无污染（阴性）玉米样品和10个无污染（阴性）大米样品，用上海飞测生物黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条每个样品检测3次，检测限（LOD）为测定平均值加3倍标准偏差，定量限(LOQ)为测定平均值加10倍标准偏差。测试结果表明，黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条的LOD为0.29μg/kg，LOQ为0.91μg/kg。
2.2准确性和重复性分析
在用国标法测定为0的不同种类空白样品中分别添加黄曲霉毒素B1浓度为1.00，2.50，5.00，10.00，25.00，50.00μg/kg的标准品，然后按照黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条的检测方法进行检测。检测结果见表1。
表1 不同样本检测的准确性和重复性
|
样品 |
黄曲霉毒素B1添加量（μg/kg） |
||||||
|
平行实验 |
1.00 |
2.50 |
5.00 |
10.00 |
25.00 |
50.00 |
|
|
大米 |
1 |
1.23 |
2.21 |
5.04 |
11.91 |
22.86 |
48.89 |
|
2 |
1.17 |
2.67 |
4.96 |
9.78 |
25.12 |
49.99 |
|
|
3 |
0.99 |
2.86 |
4.72 |
9.89 |
24.37 |
46.72 |
|
|
平均值（μg/kg） |
1.13 |
2.58 |
4.91 |
10.53 |
24.12 |
48.53 |
|
|
平均回收率 |
112.83% |
103.20% |
98.14% |
105.27% |
96.47% |
97.07% |
|
|
变异系数CV |
10.96% |
12.95% |
3.34% |
11.37% |
4.77% |
3.42% |
|
|
玉米 |
1 |
0.987 |
2.38 |
4.383 |
9.876 |
25.098 |
54.987 |
|
2 |
1.09 |
2.89 |
4.98 |
11.287 |
26.341 |
57.01 |
|
|
3 |
0.931 |
2.87 |
4.57 |
10.659 |
28.497 |
55.698 |
|
|
平均值（μg/kg） |
1.00 |
2.71 |
4.64 |
10.61 |
26.65 |
55.90 |
|
|
平均回收率 |
100.27% |
108.53% |
92.89% |
106.07% |
106.58% |
111.80% |
|
|
变异系数CV |
8.04% |
10.65% |
6.57% |
6.66% |
6.45% |
1.84% |
|
|
小麦 |
1 |
1.345 |
2.84 |
5.004 |
9.884 |
23.78 |
47.123 |
|
2 |
1.276 |
2.65 |
5.418 |
11.583 |
22.461 |
49.045 |
|
|
3 |
1.011 |
2.31 |
4.88 |
10.72 |
24.189 |
49.276 |
|
|
平均值（μg/kg） |
1.21 |
2.60 |
5.10 |
10.73 |
23.48 |
48.48 |
|
|
平均回收率 |
121.07% |
104.00% |
102.01% |
107.29% |
93.91% |
96.96% |
|
|
变异系数CV |
14.56% |
10.33% |
5.52% |
7.92% |
3.85% |
2.44% |
|
从表1可以看出，上海飞测生物科技有限公司所生产的黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条测试不同粮食谷物中黄曲霉毒素B1的添加回收率在92.89%~121.07%，3次重复的变异系数在14.56%以内。
2.3与色谱方法的对比试验结果
取大米、小麦、玉米、高粱、花生、麸皮、喷浆玉米、DDGS、豆粕受污染样品各1份，先采用国标液相色谱法进行测定，再使用上海飞测生物科技有限公司所生产的黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条进行测定，各测试3个平行样。检测结果如下：
表3 黄曲霉毒素B1荧光定量检测卡与高效液相色谱法检测值对比
|
样本 |
大米 |
小麦 |
玉米 |
高粱 |
花生 |
麸皮 |
喷浆玉米 |
DDGS |
豆粕 |
|
|
色谱值 |
9.87 |
3.98 |
16.38 |
7.73 |
45.87 |
27.21 |
34.62 |
14.87 |
2.75 |
|
|
飞测生物值 |
1 |
10.73 |
4.52 |
17.83 |
6.76 |
44.54 |
30.13 |
32.87 |
12.73 |
2.32 |
|
2 |
9.54 |
4.66 |
18.54 |
6.9 |
47.81 |
28.76 |
31.96 |
13.39 |
2.81 |
|
|
3 |
9.42 |
4.27 |
15.99 |
7.51 |
49.82 |
26.52 |
33.63 |
13.98 |
2.42 |
|
|
平均值 |
9.90 |
4.48 |
17.45 |
7.06 |
47.39 |
28.47 |
32.82 |
13.37 |
2.52 |
|
|
符合度 |
100.27% |
112.65% |
106.55% |
91.29% |
103.31% |
104.63% |
94.80% |
89.89% |
91.52 |
|
|
CV |
7.32% |
4.41% |
7.54% |
5.65% |
5.62% |
6.40% |
2.55% |
4.68% |
10.29% |
|
表2表明，在不同的粮食谷物饲料中，上海飞测生物科技有限公司所生产的黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条与液相色谱法的符合率为89.89%~112.65%，3次重复测定的的CV值在10.29%以内。
2.4方法特异性
选择其他5种常见的真菌毒素的标准品在阴性玉米中进行添加，添加的浓度为100 μg/kg，然后用飞测生物黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条进行测试，每个样品测3次取平均值；结果显示与赭曲霉毒素A，伏马菌素B1，呕吐毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮交叉反应率均＜5%。实验结果表明，黄曲霉毒素B1胶体金试剂条对伏马毒素、赭曲霉毒素、黄曲霉毒素、玉米赤霉毒素几乎无交叉反应，其方法特异性可以能满足检测要求。
表3 交叉反应率表
|
序号 |
名称 |
测定值 |
交叉反应率 |
|
1 |
黄曲霉毒素B1（DON） |
105 |
100.00% |
|
2 |
赭曲霉毒素A (OTA) |
2.32 |
2.32% |
|
3 |
伏马菌素B1（FB1） |
3.76 |
3.76% |
|
4 |
黄曲霉毒素B1(AFB1) |
2.68 |
2.68% |
|
5 |
玉米赤霉烯酮(ZEN) |
2.71 |
2.71% |
|
6 |
T-2毒素(T-2) |
1.33 |
1.33% |
3结论
本实验采用上海飞测生物科技有限公司所生产的黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸条对不同的粮食谷物饲料样本进行测试，该产品的最低检出限（LOD）为0.29μg/kg，最低定量限(LOQ)为0.91μg/kg，线性范围为1.00-50.00μg/kg，线性范围内的添加回收率为92.89%~121.07%，3次重复的变异系数在14.56%以内。与其他真菌毒素的交叉反应率均小于5%。其准确性和可靠性均可以满足欧盟和我国对黄曲霉毒素B1的分析标准的技术要求。该方法具有简便快速、准确可靠、重复性好等特点，可用于不同粮食谷物饲料中黄曲霉毒素B1的快速定量检测分析。
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