呕吐毒素DON又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇,是一种无色针状结晶,熔点为151℃~152℃,具有较强的热稳定性,在121℃高压加热25min下仅少量呕吐毒素被破坏。呕吐毒素DON是由镰刀菌属霉菌所产生的毒性代谢产物。镰刀菌属通常在作物生长期间就感染,其最适生长温度为5℃~25℃,最适生存环境为长江以北大部分地区。呕吐毒素多分布于小麦、大麦、玉米等谷物籽实中,在谷物和饲料中检出率极高,是在黄曲霉毒素之后污染最严重的霉菌毒素。近两年猪场的腹泻性疾病给呕吐毒素有直接关系,应引起猪场重视。
呕吐毒素对人和动物均有很强的毒性,12、13-环氧基团是呕吐毒素的毒性结构(图1),
能引起人和动物呕吐、腹泻、皮肤刺激、拒食、神经紊乱、流产、死胎、免疫抑制等(Desjardins,2006;Eriksen等,2004;Morgavi和Riley,2007),猪是对呕吐毒素最敏感的动物,家禽次之,反刍动物由于瘤胃微生物的作用,耐受力最强。对生长肥育猪而言,含有12~14g/t呕吐毒素的饲料饲喂后10~20min即会出现呕吐、不正常的焦虑和磨牙现象,含毒量19g/t以上即完全拒食(Trenholm等,1994;Williams等,1988)。
呕吐毒素具有很强的细胞毒性,对原核细胞、真核细胞、植物细胞、肿瘤细胞等均具有明显的毒性作用,对生长较快的细胞如胃肠道黏膜细胞、淋巴细胞、胸腺细胞、脾细胞、骨髓造血细胞等均有损伤作用。呕吐毒素可能通过3种不同的方式对原核细胞产生毒性作用:1)通过渗透磷脂双层,作用于亚细胞水平;2)通过与细胞膜相互作用;3)通过自由基介导的脂质过氧化作用。
呕吐毒素是一种免疫抑制剂,能抑制蛋白质和DNA、RNA的合成及线粒体的功能,阻止细胞分裂和膜的功能。呕吐毒素通过其倍半萜烯结构抑制转录、翻译过程,引起免疫抑制作用,造成疫苗效价低下(Azconaolivera等,1995;Nelson,2002;Eriksen等,2004;Pestka和Smolinski,2005;Rocha等,2005;Stark,2005;Zhou等,2005a)。
1、呕吐毒素的污染状况
1.1世界范围内的污染情况
据报道,全球生产的饲料中至少45%污染了已知的霉菌毒素。联合国粮农组织估算,全世界由于霉菌毒素污染造成的损失,每年达数千亿美元,而对人畜造成的危害更是难以统计(计成等,2008;2009)。
BIOMINGmbH与新加坡罗马实验室(RomerLabsSingaporePteLtd.)从2007年10月至2008年9月合作实施霉菌毒素普查项目,共进行了5192项对农业和畜牧业来说最重要的几种霉菌毒素—黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZON)、呕吐毒素(DON)、烟曲霉毒素B1(FUM)和赭曲霉毒素A(OTA)的检测。分析的样品有玉米、小麦、大米及加工副产物如豆粕、玉米蛋白粉、DDGS(蒸馏干燥玉米酒糟),以及一些草料如秸秆、青贮和全价料,总数为1086份。结果显示,所有的检测样品中,AFB1、ZON、DON、FUM和OTA的阳性污染率分别为31%、46%、54%、54%和19%。所分析样品的50%来源于北亚区域,而且大多数来源于中国大陆。北亚区样品中DON的发生率非常高,76%的样品呈阳性(平均含量873mg/t)。本次普查所发现的DON最高含量(32893mg/t)样品为来源于中国的全价料样品(DIInesRodrigues,2009)。
值得我们关注的是,近年来,玉米作为原料发酵酒精的用量越来越大,随之产生的大量副产品蒸馏干燥玉米酒糟(DDGS),也正在被普遍应用到饲料中,然而,霉菌毒素污染成为使用DDGS的巨大障碍,这是因为酒精发酵的过程不但不会破坏霉菌毒素,最终的DDGS反而会使霉菌毒素浓缩2~3倍(Zhou,2007内部资料)。
1.2中国呕吐毒素污染现状
农业部饲料质量监督检验测试中心(成都)2014年从全国七大区域中选择一些有代表性的省份(辽宁、河北、河南、湖南、广东、福建、江西、山东、四川、贵州以及陕西)的饲料和养殖企业,采集了7种主要饲料原料(玉米、豆粕、菜粕、棉粕、小麦、小麦麸、鱼粉)及2种主要配合饲料,共计1018个样品。呕吐毒素平均检出率为95.5%,超标率呈现北高南低的趋势,平均为18.7%(表1、图2)。
国家粮食局标准检测中心2014年6月对河南、湖北两省13个地市的小麦400份样本检测,黄曲霉毒素检出率18.3%,未超标;呕吐毒素检出率62%,其中70%超标;玉米赤霉烯酮检出率58%,其中60%超标。
2、呕吐毒素的生物分解
到目前为止,没有更有效的方法解决霉菌毒素污染的问题,常用的脱毒方法是将污染的饲料原料按照比例稀释或向饲料中添加霉菌毒素吸附剂(沸石或者膨润土)、酵母细胞壁等等。但是这些方法都存在着各自的缺陷。稀释法容易造成二次污染,吸附法的缺点是吸附剂没有选择性,而且对营养物质的吸附要大于霉菌毒素。通常,吸附方法对那些具有极性基团并且其极性基团处于适当位置,很容易被吸附的霉菌毒素有效(黄曲霉毒素)。但是,很多毒素比如单端孢霉烯毒素(呕吐毒素、T-2毒素等)、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素等,不能被完全吸附。而且对于营养物质和饲料中矿物质吸附也严重。此外,吸附脱毒的效率很大程度上取决于环境pH。
生物分解由于其有效性、针对性和环境友好性,将是未来霉菌毒素脱毒的一种趋势。酶解脱毒是控制饲料霉菌毒素风险的有效方法,可以解除很多不能被吸附脱毒的霉菌毒素。通过使用酶来改变毒素的结构,将毒素转化成为对动物无毒的物质。克隆得到其基因序列并成功转化到毕赤酵母表达系统中,还对该酶的固定化技术进行了研究。
分解呕吐毒素早在20世纪60年代被发现(Horvath和Varga,1961),此后,从动物肠道、土壤和植物等不同来源得到的微生物混合物被证明能够分解霉菌毒素(Yoshizawa等,1983;Kiessling等,1984;Swanson等,1988;Beeton和Bull,1989;He等,1992;Kollarczik等,1994;Matsushima等,1996;Volkl等,2004)。Zhou(2007)总结了历年来报道的所有能够分解呕吐毒素的微生物种类(表2)。
呕吐毒素(DON)分解成无毒性的化合物,12、13-环氧基团是呕吐毒素的毒性结构,去除这种环氧基团就能显著降低其毒性,比如DON就可以分解为DOM-1(图3、图4)。Yoshizawa等在小鼠的尿液和粪便中发现,呕吐毒素的环氧基团在酶的作用下发生去环氧化反应,生成二烯。但是此项研究进展一直是很艰难的,原因是很少有人分离出具备解毒活性的单独菌株。Binder等在2000年提纯出能够将呕吐毒素的环氧结构进行生物转化的细菌品系,他们从瘤胃内容物中分离到能够将呕吐毒素进行转化脱毒的混合活菌群,进一步分离出所需要的菌株,命名为BBSH797。但是据后来Zhou等对该产品的评价表明(内部资料),该产品的解毒作用不理想,原因可能是因为微生物来源于瘤胃,不适合在家禽和猪的肠道中生长。
近年来,霉菌毒素污染对畜牧生产的负面影响逐渐被人们认识,尤其是呕吐毒素在我国谷物及饲料产品中检出率和超标率都居高不下,是我国北方粮食主产区的主要污染毒素。国外对于呕吐毒素的研究刚刚起步,国外的科研机构已经开始针对霉菌毒素的生物降解开展一系列研究,针对不同的霉菌毒素分离出降解的微生物和酶。在中国,还没有见到呕吐毒素降解菌以及解毒酶相关的研究报道,筛选出能够产高效降解呕吐毒素酶的菌株以及通过酶工程、基因工程等手段获得高效表达的解毒酶是当前研究的方向。我国政府也应该重点支持霉菌毒素生物降解领域的研究,毕竟,谁占领了技术的制高点谁就拥有了话语权。
上海飞测生物基于全球领先的荧光定量POCT检测技术平台,率先推出了呕吐毒素荧光定量快速检测卡(荧光定量免疫层析法)和呕吐毒素定量检测仪,结合了胶体金的快速和酶联免疫的定量的优点,可在10min内快速定量检测各种粮食谷物(如小麦、大麦、玉米、大米、面粉等)、饲料原料(麸皮等)及部分饲料中呕吐毒素的含量,样品前处理简单,操作简便,采用荧光定量检测仪读数,结果准确可靠,符合HPLC结果,适用于各类粮食、粮油、饲料加工企业及检测机构。
一、呕吐毒素荧光定量快速检测卡性能
1、 灵敏度:25ng/mL;
2、 定量线性范围:100.0ng/mL - 5000.0 ng/mL;
3、样品前处理时间:8min;
4、检测时间:10min;
5、准确度:添加回收率为80%-125%;
6、 特异性:在1000 ng/mL浓度水平下与其它真菌毒素无交叉反应;
二、呕吐毒素荧光定量快速检测卡样品前处理过程
三、呕吐毒素荧光定量快速检测卡检测过程操作示意图
四、呕吐毒素定量检测仪结果判读和输出
呕吐毒素荧光定量快速检测卡采用便携式呕吐毒素定量检测仪进行读数,使得检测结果更加准确、客观,避免人为的误判。
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